Возможности MISEQ (ILLUMINA) PLATFORM для анализа генома льна

POTENTIAL OF MISEQ (ILLUMINA) PLATFORM FOR FLAX WHOLE

-TRANSCRIPTOME ANALYSIS

Gorshkov O.*, Mokshina N., Gorshkov V., Gogolev Y., Gorshkova T.

Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Kazan, Russia

*e-mail: o_gorshkov@mail.ru

-

Generation Sequencing is the approach that made the revolution in molecular biology, including plant biology. However, its application to study transcriptome of multicellular organisms faces the challenge of sample heterogeneity: as a rule, tissue mixture is analyzed, giving average values for cells of different types and at various stages of  development. We used platform MiSeq Illumina for whole-transcriptome analysis of certain plant cell type at certain developmental stage. Such experiment was performed on the developing in planta phloem fibers of flax (

Linum usitatissimum L.) at the stage of tertiary cell wall formation. Such cell wall type is rich in cellulose (up to 90%) and lacks detectable xylan an d lignin; the mechanisms of tertiary cell wall formation are largely unclear. Presence of thick cell wall gave possibility to isolate fiber bundles by washing stem tissues in 80% ethanol. For comparison, stem portions containing fibers with only primary ce

ll wall were used. A cDNA library for each sample was sequenced using single

end read sequencing on a MiSeq System. The reads (75bp) were mapped to the flax genome sequence using TopHat. Reference-based assembly of the aligned

reads and the estimation of transcript abundance in terms of Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped fragments (FPKM) was performed using the

Cufflinks protocol. From 19,3 to 24,2 million reads per sample were acquired, having quality scores Q30. About 95% of reads were successfully mapped to the

reference sequence. The mean gene expression levels indicated that 62.6% had FPKM values between 1 and 100, 5.4% of genes had the expression value above 100. A total of 32098 from 43484 protein-coding genes were expressed, of which 1

124 differentially expressed genes (DEGs) were detected with a q-value less 0,05. Validation of transcriptome profiling results using qRT-PCR was performed (23

genes). DEG characterization would be given in presentation

PlantGen, Novosibirsk, Russia, June17–21, 2015, стр. 19-20

--------  

ПОТЕНЦИАЛ MISEQ (ILLUMINA) ДЛЯ АНАЛИЗА ТРАНСКРИПТОМА  ЦЕЛОГО ЛЬНА

-

Горшков О.*, Мокшина Н., Горшков V, Гоголев Ю., Горшкова Т.

Казанский институт биохимии и биофизики, Казани, Россия

*электронная почта: o_gorshkov@mail .ru

-

Изучение многоклеточных организмов сталкивается с проблемой типовой разнородности: как правило, анализируется смесь тканей, а получаемые значения для клеток различных типов и на разных этапах развития усредняются. Что не позволяет  детально изучить процессы роста клеток.

  Нами был выполнен эксперимент на растущих волокнах флоэмы льна (Linum usitatissimum L.) в стадии третичного формирования клеточной стенки с помощью метода на платформе MiSeq Illumina.  Такой тип клеточной стенки богат целлюлозой (до 90%) и испытывает недостаток в обнаружимом ксилане d лигнин. При этом механизмы третичного формирования клеточной стенки в основном неясны.

Наличие толстой клеточной стенки позволило изолировать связки волокна, промывая ткани основы в 80%-м этаноле. Для сравнения использовались части основы, содержащие волокна с только основной клеточной стенкой. Библиотека комплементарной ДНК для каждого образца была упорядочена, используя единственный конец, прочитанный, упорядочив на Системе MiSeq. Расшифрованная последовательность (75bp) была нанесена на карту последовательности генома льна TopHat.

Нами было установлено и  успешно нанесено на карту приблизительно 95%  последовательностей фрагментов ДНК. Средние уровни экспрессии гена указали, что у 62.6%  значений FPKM находились между 1 и 100, у 5.4% генов была стоимость выражения выше 100. В общей сложности 32098 из 43484 кодирующих белок генов были установлены, из которых 1124 дифференцированно.  

Материалы 3-й международной конференции

“Генетика, геномика, биоинформатика и биотехнология растений”. PlantGen 2015